地化所建立基于生物传感器的土壤重金属检测系列新方法
传统重金属检测方法依赖大型仪器，需要复杂繁琐的前处理过程、高昂的检测成本以及较长的检测周期，并且传统检测方法还面临灵敏度不高和智能化程度低的难题。因此，迫切需要建立高灵敏度及智能化重金属检测方法，以弥补传统方法的不足。生物传感器是一种快速检测方法，具有响应迅速、成本低、灵敏度高以及便与携带等优点，可以很好地克服传统检测方法的局限，在重金属简单、快速、高灵敏检测方面具有很大的应用前景。中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室刘承帅研究员团队与广东省科学院生态环境与土壤研究所陈俊华研究员等合作，成功建立了以功能核酸为分子识别元件的重金属生物传感器，实现了对重金属的超灵敏、智能化快速检测，并构建了土壤有效态重金属检测新方法。
（1）建立了DNA网状纳米结构生物传感器，实现对土壤重金属的超灵敏检测
创新性地以双茎环DNA探针为自组装元件，当反应体系中存在待检重金属（以铀离子为例），释放的核酸片段可激活DNA组装，经过多重循环的核酸杂交及链置换反应，形成一种DNA网状纳米结构的荧光生物传感器。该荧光生物传感器对铀离子的检测线性范围为10 pM到1 mM，检测限为2 pM，能实现对土壤样品中痕量铀污染的超灵敏检测。该荧光生物传感器操作简单，响应迅速，信号扩增效率高效，为土壤重金属的超灵敏检测提供了一种新方法。
图1.（A）DNA网状纳米结构生物传感器检测重金属原理。（B）原子力显微镜表征组装的DNA纳米结构。（C）检测限和检测灵敏度分析。
（2）建立分子逻辑门生物传感器，在分子水平上实现重金属的智能化检测
以有效态铅和有效态镉两种重金属为目标物，基于二进制原理，以0和1对重金属进行编码，以功能核酸为重金属分子识别元件，通过核酸并行运算和杂交反应，构建了多种分子逻辑门生物传感器，包括OR、AND、XOR、INHIBIT、半加器、半减器等。在生物传感逻辑运算中，0表示检测体系中不存在有效态铅或镉；1表示检测体系中存在有效态铅或镉。以FAM和Cy5进行双通道荧光标记，根据真值表排布，不同的重金属组合，会产生不同的荧光输出信号，从而在分子水平上为重金属的智能化检测提供一套新的传感体系。
图2.（A）分子逻辑门生物传感器用于有效态重金属的智能化检测。（B）半加器分子逻辑门生物传感器结果。（C）半减器分子逻辑门生物传感器结果。（D）半加器分子逻辑运算真值表。（E）半减器分子逻辑运算真值表。
（3）建立DNA荧光生物传感器，实现对土壤有效态重金属的免萃取、简单、快速检测。
目前土壤有效态重金属检测方法众多，包括BCR法、Maiz三步连续提取方法、Tessier五步连续提取法、DTPA-CaCl2法等，但适用条件等存在较大的争议，比如强酸强碱等化学试剂介导的重金属萃取难以反映土壤中有效态重金属的真实含量。同时，这些方法需连续多步的萃取分离过程，步骤繁琐，耗时较长。因此，探索构建一种无需消解萃取、且能真实反应土壤中有效态重金属含量的快速检测方法具有重要意义。
以生命体基元DNA为有效态重金属识别探针，通过DNA识别、切割以及信号转换，构建了DNA荧光生物传感器，实现了对土壤有效态重金属（铅、镉、铜等）的快速检测。该方法操作简单、无需复杂的连续萃取过程，DNA探针混合即可检测，响应迅速，方便现场快速分析。该荧光生物传感器对有效态铅的检测灵敏度可达到0.2 pM，用于土壤样品有效态重金属检测时，与传统DTPA-CaCl2法相比，误差小于10%，具有高灵敏度和高特异性，可满足复杂样品中有效态重金属检测需求。
图3.（A）DNA荧光生物传感器用于有效态重金属检测原理。（B）有效态重金属检测灵敏度分析结果。
以上成果发表于分析化学和环境科学领域的重要期刊，包括分析化学领域的自然指数期刊Analytical Chemistry、分析化学传统综合性期刊Talanta以及中科院一区期刊Science of The Total Environment。相关技术也分别申请发明专利。该系列研究得到了国家重点研发划(2020YFC1808500)、国家自然科学基金(42025705、42330712)和贵州省高水平人才项目（GCC[2022]002-1）等资助。
论文信息：
[1] Junhua Chen, Xu Wang, Junhui Guo, Yiwen Lv, Manjia Chen, Hui Tong, Chengshuai Liu*. Heavy metal-induced assembly of DNA network biosensor from double-loop hairpin probes for ultrasensitive detection of UO22+ in water and soil samples. Analytical Chemistry 2024, DOI: 10.1021/acs.analchem.3c05526.
[2] Junhua Chen, Xu Wang, Yiwen Lv, Manjia Chen, Hui Tong, Chengshuai Liu*. Intelligent monitoring of the available lead (Pb) and cadmium (Cd) in soil samples based on half adder and half subtractor molecular logic gates. Talanta 2024, 271, 125681.
[3] Junhua Chen, Manjia Chen, Hui Tong, Fei Wu, Yizhang Liu, Chengshuai Liu*. Fluorescence biosensor for ultrasensitive detection of the available lead based on target biorecognition-induced DNA cyclic assembly. Science of The Total Environment 2023, 905, 167253.
发明专利信息：
[1] 刘承帅，陈俊华，孙静，陈曼佳，童辉。一种高灵敏检测有效态铅的荧光生物传感器及其应用。申请号：202310674628.9。
[2] 刘承帅，陈俊华，孙静，陈曼佳，童辉。一种高灵敏检测有效态镉的荧光生物传感器及其应用。申请号：202310664759.9。
[3] 刘承帅，陈俊华，陈曼佳，孙静，吴非，孟方圆。一种检测铅和镉的半减器分子逻辑门智能化检测系统及其应用。申请号：202310986994.8。